杨辉, 马修兵, 孙彦飞, 王铁栋, 庆丰, 赵雪松. 小型荧光激光雷达测量六种典型生物战剂模拟物二维荧 光光谱[J]. 光谱学与光谱分析, 2019,39(3): 802-806.

YANG Hui, MA Xiu-bing, SUN Yan-fei, WANG Tie-dong, QING Feng, ZHAO Xue-song. 2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range   Lidar[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2019,39(3): 802-806.

Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2019)03-0802-05 Permissions

小型荧光激光雷达测量六种典型生物战剂模拟物二维荧光光谱

杨辉 1  , 马修兵 2, 孙彦飞 1, 王铁栋 1, 庆丰 1, 赵雪松 3 摘要

关键词: 生物战剂; 模拟物; 近场荧光激光雷达; 导数荧光光谱 中图分类号:TN247 文献标志码:A

2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range Lidar

YANG Hui1, MA Xiu-bing2, SUN Yan-fei1, WANG Tie-dong1, QING Feng1, ZHAO Xue-song3

Abstract

Keyword : Bioagents; Simulants; Short range fluorescence lidar; Derivative fluorescence spectra

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引 言

生物战剂在大气中的散布能对军民用设施和人员造成极大的危害,  目前缺乏切实有效的探测和识别 手段[1] 。 对生物战剂的遥测和先期预警, 避免和减少人员、 设施和装备伤亡, 尤为重要。 在光学生物

战剂遥感领域, UV-LIF 在探测和识别方面发展迅速。 原则上, 蛋白质、 病毒、 细菌和其他生物有机 物, 至少含有一种以上的荧光团, 可以在特定紫外光的激励下发射出荧光, 且这些生物物质发出的荧光，与其所含生物荧光团的特定分子结构、 外部环境或溶质的物化特性等密切相关, 因而在荧光谱特征方面 表现出极大的差异性[2,3]。

成团泛菌 Pantoea agglomerans(Pan)原名草生欧氏杆菌是植物体上常见的附生菌, 是土拉杆菌  的模拟物; 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus(Sta)是一种重要的条件致病菌, 广泛分布于自然  界, 可以引起人和动物的软组织感染, 并可导致生命威胁的肺炎、 菌血症及包括心内膜炎、 脓毒性关节 炎、 骨髓炎等的严重并发症, 还能引发食物中毒及中毒性休克综合症等,  占社区和医院感染源的 60%和 80%; 大肠杆菌 Escherichia coli(EH)广泛分布于自然界, 包括腐生菌、 寄生菌和人及动物的病原菌,   多数是人和动物肠道正常菌群的重要成员, 1949 年— 1969 年的 20 年间, 美国在狄特里克堡试验  场、 道格威试验场和化学中心等 34 个非公共场大约进行了 108 次曲霉菌和大肠杆菌模拟生物战剂 测试; 球芽孢杆菌 Bacillus globigii(BG)是炭蛆杆菌的非致病性模拟物, 其孢子形态形状与炭蛆杆菌极  为相近, 休眠态孢子可以抵御多数苛刻恶劣的外部环境, 在环境适宜时则迅速生长。 2000 年前后的数十 年, 加拿大国防部, 就一直持续地将球芽孢杆菌作为炭疽杆菌进行研究。 成团泛菌、 大肠杆菌为革兰氏 阴性杆菌, 球芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌。

数十年来, 大多数学者都将工作聚焦在生物战剂光学(如荧光, 磷光)遥测领域, 极少对生物战剂模  拟物的选择, 培养及荧光光谱等方面的研究进行报道[4,5,6,7,8] 。 本工作对成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌四种常见的细菌类生物战剂模拟物[9]的培养和荧光光谱测定, 以及两种毒素 类生物战剂模拟物的荧光光谱测定情况进行了报道, 对光谱特征进行了分析, 并讨论了光谱指纹特征的抽 取方法, 为生物战剂荧光光谱特征数据库的建立, 打下了基础。

1 材料及荧光测量平台

1.1 生物战剂模拟物

选取了四种典型细菌类生物战剂模拟物和两种毒素类生物战剂模拟物, 其中, 细菌类模拟物为成团 泛菌、 金黄色葡萄球菌金黄亚种Staphylococcus aureus subsp. Aureus(Sta)、 大肠杆菌(大肠埃 希氏菌)和球芽孢杆菌, 毒素类模拟物为牛血清 BSA 和卵清蛋白 OVA。 BSA 和OVA 均来自 Sigma

Aldrich, 成团泛菌、 金黄色葡萄球菌金黄亚种、 大肠杆菌(大肠埃希氏菌)和球(芽孢)杆菌均购自中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 编号分别为 CGMCC 1.4006, CGMCC 1.128, CGMCC  1.2812 和 CGMCC 1.1202。

1.2 菌种复壮与培养

用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管, 在超净台( 型号 SW-CJ-1D)无菌环境中旋  开装有复溶液的滴瓶盖, 取约 1 mL 复溶液, 加入到冷冻管中, 轻轻振荡, 使冻干菌株溶解呈悬浮状。 用 无菌吸管吸取菌悬液, 转移到复溶液滴瓶中。 做好标识, 在 HNY-2102C 立式恒温振荡培养箱(天津欧   诺)中适宜温度下培养。 成团泛菌和大肠杆菌的培养基为 LB 培养基, 金黄色葡萄球菌和球芽孢杆菌的培  养基为 TSB 培养基, 配制好后用高压蒸汽灭菌 17 min。 TSB, LB 培养基的 pH 测定和调节由 pH 计

(Sartorius, 型号 PB-10)完成。 成团泛菌和球芽孢杆菌的培养温度为 30 ℃, 金黄色葡萄球菌和大肠杆 菌的培养温度为 37 ℃。

1.3 荧光测量平台

荧光物质在紫外激光的激励下, 会辐射出宽谱荧光, 不便于类型的识别。 为提高类型辨识能力, 激 光器输出的 3 倍频 355 nm、 4 倍频 266 nm 波长激光, 分别用于氨基酸荧光分子、 NADH 和维生素 B 荧光的荧光和偏振测量, 355 和 266 nm 两个波长的激光能量脉宽均为 5 ns, 脉冲能量约为 5 mJ, 重复频率为 10 Hz。 荧光信号由 400 mm 口径的牛顿型望远镜收集, 并由光谱仪进行分析, 其分辩率为  2/4 nm。 荧光的探测范围为 250650 nm, 探测距离不小于 20 m。 图 1 为近场激光雷达的荧光测量 原理图。

2 四种菌的生长曲线测定

2.1 样品准备和测定方法

在振荡培养箱里, 对成团泛菌、金黄色葡萄球菌、球芽孢杆菌和大肠杆菌等四种典型细菌类生物战剂模拟物进行了 28 h 的平行培养。然后, 在超净台中按无菌操作进行菌液准备, 即取已经划过线的固体培养基, 用无菌牙签沾取少量的菌体置于含有约50 mL 的液体TSB 或LB 培养液中, 放置于30 ℃/37 ℃恒温振荡培养箱内, 每隔2H分别吸取成团泛菌、金黄色葡萄球菌、球芽孢杆菌和大肠杆菌营养肉汤培养液1 mL, 并用10 mL 0.9%无菌氯化钠溶液稀释成菌悬液, 用UV1102 紫外可见分光光度计测定四种菌液在600 nm 波长上的吸光度, 用0.9%无菌氯化钠溶液作为空白参比, 记录四种菌液的吸光度值OD。OD 测量均重复三次, 直至菌液OD 值达到平稳状态。

2.2 吸光度测量结果及讨论

从细菌复活后的芽孢态开始, 分别对各菌不同生长时期的吸光度值进行了三次重复测定, 得到了各菌的生长线。由图2 可知：

(1)在设定的培养条件下, 四种菌的生长阶段较为明显, 主要有萌发期、对数生长期、平稳期和衰亡期。 其中, 球芽孢杆菌和成团泛菌两种菌的萌发期较短, 可能是菌种培养环境与现有培养环境相近, 在培养初期溶氧和酸碱度都较为适宜, 菌种极快地适应了新环境并对数生长; 球芽孢杆菌和成团泛菌的对数生长期持续约4 h, 从第4 小时后到第24 小时结束为过渡平稳期, 之后进入稳定平稳期。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的萌发期相对较长, 约为15 小时和6 小时; 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的对数生长期分别为2 和6 h。成团泛菌、金黄色葡萄球菌、球芽孢杆菌和大肠杆菌的代时分别为0.99, 0.835, 1.07  和 1.909 h。

(2)只有大肠杆菌有明显的衰亡期, 在约5 h 的平衡期后, 大肠杆菌进行营养和空间的竞争, 有些大肠杆菌死亡, 吸收率随即开始衰减, 其整个生命周期呈“ J” 型; 说明细菌的培养生长曲线受遗传性、 接种量和培养条件等因素的影响, 会有所变化。

3 荧光光谱测量

3.1 液态气溶胶准备

BSA 和OVA 气溶胶配制: 在超净台用去离子水 ddH2O 稀释, 得到的溶液浓度约为 1.0× 106和5.0× 106 个 · mL-1, 摇匀后4 ℃静置 10 min, 荧光待测。

成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌营养态细菌气溶胶配制: 在超净台分别汲取过夜培养(约 24 h)后的 Pan, Sta 和 BG 菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理盐水的离心管中, 在 7 500 r · min-1转速下离 心 10 min 两次, 去掉上清液, 再分别加入 10 mL 生理盐水, 摇匀后 4 ℃静置 10 min, 荧光待测。

大肠杆菌营养态细菌气溶胶配制: 在超净台分别汲取 15 h 培养后的菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理 盐水的离心管中, 在 7 500 r · min-1转速下离心 10 min 两次, 去掉上清液, 再分别加入 10 mL 生理盐 水, 摇匀后 4 ℃静置 10 min, 荧光待测。

3.2 荧光测量方法

荧光测量在距离激光雷达约 20 m 的喷雾型测量腔中进行。 气溶胶室长 15 m, 尺度为 2.0 m × 2.0 m。 两端配有活动门, 挂起时可以关闭, 放下时打开。 测量方法: (1)室门关闭, 将选定的 BSA、OVA、 成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌营养态气溶胶, 在数秒时间内利用气流式 雾化器和风扇, 充分混合均匀, 并保留 10 s 以确保室内具有良好的各向同质性; (2)然后打开腔前门, 用 激光雷达完成荧光测量; (3)激光雷达数据采集结束后, 打开后门, 在数分钟内清空测量腔中的气溶胶;(4)测量腔中气溶胶清空并紫外线灭菌后分别测量同等浓度超纯水和生理盐水的荧光背景信号, 作为参比 扣除。

3.3 雷达回波的小波去噪和平滑

在激光回波检测中使用的去噪方法有匹配滤波、平滑滤波等; 当信号波形已知时, 匹配滤波方法能 够有效地实现信号检测, 是输出信噪比较大化意义上的线性滤波器, 但对于非平稳的回波信号其性能会大 幅下降。 尤其是, 滑动平均滤波只相当于低通滤波器, 中值滤波降噪优势是消除孤立的噪声, 当信噪比很 低时, 改善信噪比性能有限[9,10]。

荧光信号较 MIE 散射信号低数个数量级, 为尽可能地保留信号光谱的特征, 不能采用常规的平滑降 噪处理, 对激光雷达的原始 PRR 信号, 采用了分解级数为 4 的 Daubechies(db4)小波基, 与滑动平均方 法比较而言, 利用该小波去噪可以更好地保留了激光雷达回波信号的峰值特征。

3.4 2D 荧光发射谱和二阶导数荧光发射谱

根据生长曲线, 大肠杆菌取 15 h 菌液, 其他三种则是 24 h 菌液, 在荧光测量腔中进行荧光和背景 测量。 去除信号中的拉曼和瑞利散射信号后, 经归一化, 得到了如图 3 所示的各模拟物液态气溶胶的二  维荧光发射谱。 经与色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸的本征二维荧光谱对比分析后, 可得到以下结论:

(1)BSA, OVA 以及成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌营养态细菌气溶胶的二 维荧光谱分布、 谱形与色氨酸一致性较高, 荧光谱的半高宽 FWHM 为 60 nm, 说明其主要成份为色氨 酸, 酪氨酸和苯丙氨酸的荧光贡献基本为0;

(2)相对于色氨酸的 280/350 nm 本征荧光峰, 其他所有模拟物的荧光发射中心波长均存在不程度 的紫移, 其中 OVA 和 BSA 的荧光发射波长分别紫移了 18 和 12 nm, 荧光峰位于 280/332 和280/338 nm; 金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、 球芽孢杆菌的荧光发射波长紫移了 10, 16, 8 和 16 nm, 荧光峰位于 280/340, 280/336, 280/342 和 280/334 nm;

(3)仅利用单个或数个激发波长得到的发射谱, 要区分和识别不同生物物质, 较为不易。 而将光谱 进行高阶处理, 如求解二阶导数, 得到二阶导数谱, 以将光谱曲线的差异放大。 对荧光光谱求二阶导数 后, 光谱谱带变窄, 二阶导数光谱的极小值对应荧光光谱峰值, 在定量测量上表现出很高的灵敏性[11] 。 图 3(b)示出了三种液态生物气溶胶和标准荧光组分色氨酸的二阶导数谱, 可见二阶导数的最小值, 与图 3(a)中的荧光峰值位置一致。 此外, 二阶求导后的谱曲线变得非常杂散, 不平滑, 这主要是由于被测物 浓度低, 受背景影响较大所致。